單萜吲哚生物鹼（MIAs）是一類來自植物的複雜天然產物，具有廣泛的醫療特性，可用於生產抗癌藥物長春新鹼和長春鹼、血管擴張劑育亨賓以及抗瘧藥奎寧。其中，長春新鹼和長春鹼作爲重要的微管抑制劑，需求最爲迫切。然而，傳統的從長春花中提取的方法產量低、成本高，難以滿足不斷增長的臨牀需求。得益於酶鑑定技術和合成生物學工具的發展，近年來，已有超過 30 種來自植物的異源酶在釀酒酵母中表達，實現了長春鹼前體的從頭合成。作爲 MIA 的前體物質，荊芥醇的添加可以促進工程化細胞中 MIA 的生產。除此以外，該物質還有多種功能，例如，作爲茶蚜的性信息素，用於有機茶葉種植中的害蟲管理；作爲生物活性化合物，能夠刺激貓產生愉悅感並防禦蚊子，可用於貓糧和貓玩具的添加劑。荊芥醇的生物合成涉及從香葉基焦磷酸（GPP）經過香葉醇合酶（GES）、香葉醇 8- 羥化酶（G8H）、香葉醇氧化還原酶（GOR）、鳶尾素合酶（ISY）和類似乳液主要蛋白酶（MLPL）的五步反應。然而， GPP 池數量的不足、植物源性細胞色素 P450（CYP）酶 G8H 的表達不佳和催化活性有限，以及副產物形成造成的代謝通量流失，制約了其生產效率。在酵母細胞器中，分隔生物合成途徑是應對理化環境不理想、與細胞質間的代謝交叉和隔離毒性代謝物等問題的常見方法。研究表明，過氧化物酶體對細胞生長並非必須，且在大小和數量方面易於調節。通過將生物合成途徑靶向到過氧化物酶體中，可以充分利用過氧化物酶體中的乙酰輔酶 A 並避免 GPP 的內源性競爭，從而提高目標產物的產量和酵母對產物的耐受性。圖 | 從頭生物合成荊芥醇的代謝工程策略（來源：Metabolic Engineering）
畢赤酵母作爲一種非傳統酵母，因在植物天然產物的生物合成中展現出顯著優勢而被寄予厚望。近期，來自浙江大學的研究團隊成功地建立了高效的畢赤酵母細胞工廠，用於香葉醇、8- 羥基香葉醇和荊芥醇的從頭合成。通過關鍵限速酶過表達、CYPs 的蛋白質工程、ERG20 的動態調控、二倍體工程和過氧化物酶體區室化的策略，在 5L 生物反應器中使用補料分批發酵，滴度高達 4429.4 mg/L。這項研究已經以“Metabolic engineering of Pichia pastoris for overproduction of cis-trans nepetalactol ”爲標題發表在 Metabolic Engineering 上。該文章的通訊作者是生物質化工教育部重點實驗室副主任，浙江大學化學工程與生物工程學院研究員連佳長博士，他的研究方向是基於合成生物學原理和基因組編輯技術的人工細胞工廠創建。（來源：Metabolic Engineering）在這項研究中，研究團隊首先在畢赤酵母中建立起香葉醇的生產過程，爲解決副產物形成和香葉醇的毒性問題，他們引入了融合酶 t43CrGES-ERG20ww 和帶有增強型過氧化物酶體靶向信號類型 1（ePTS1）標記的 t43CrGES-ERG20ww，觀察顯示 GPP 和香葉醇能夠穿過過氧化物酶體膜；爲進一步提高產量，他們將兩個額外的 t43CrGES-ERG20ww 編碼基因和一個截短的 tHMGR 基因整合到以上菌株中，使得香葉醇滴度分別增加 2 倍和 3 倍。隨後，他們刪除了 OYE2 和 OYE3 的變體以減少催化副產物形成，但香葉醇產量未提高，這表明可能存在其他未知內源性酶參與副產物合成。此外，他們嘗試在過氧化物酶體中重構整個 MVA 途徑，發現這一過程這減少了對細胞質前體的需求並潛在地減少了過氧化物酶體的質量傳遞阻力，與細胞質菌株相比，過氧化物酶體菌株的香葉醇滴度增加倍數更高。早前的研究證實，香葉醇向 8- 羥基香葉醇的轉化由 CYP 酶 G8H 催化，這被認爲是主要限速原因。而細胞色素 P450 還原酶（CPR）在 G8H 電子轉移中起關鍵作用，因此，研究團隊對 G8H 和 CPR 的組合進行優化，發現來自金銀花的 LjG8H 與來自擬南芥的 tATR1 的組合對 8- 羥基香葉醇產量提高最爲顯著。爲減輕內質網負擔，研究團隊截斷了 LjG8H 的不同區域，並整合到產香葉醇的菌株中。結果顯示，t24LjG8H 與 CrCPR 的組合在細胞質中顯著提高了 8- 羥基香葉醇產量，滴度達到 319.0 mg/L；且過氧化物酶體中的 t19LjG8H 與 CrCPR 組合也大幅提升產量，滴度增加了 57 倍以上。圖 | G8H 和 CPR 的蛋白質工程和亞細胞定位示意圖（來源：上述論文）隨後，研究團隊構建了生產荊芥醇的菌株。他們首先將 GOR、ISY 和 NcMLPL 基因整合到生產 8- 羥基香葉醇的菌株的基因組中。然而，由於 CrISY 的混雜性，產生了香茅醇等副產物。通過優化基因來源（使用 NmISY）和培養基（選擇 YPD），荊芥醇的產量顯著提高，副產物生成減少。進一步的研究發現，在過氧化物酶體中只有不到 3.0% 的 8- 羥基香葉醇被轉化爲下游途徑，他們推測這可能與輔因子供應和過氧化物酶體區室化對酶活性的影響有關。最終，他們採用兩階段發酵方法，通過在發酵液中添加 20%（v/v）的異辛烷（IPM）來促進畢赤酵母中荊芥醇的合成，有效減輕了荊芥醇的細胞毒性，並提高了產量。爲了避免與內源性甾醇生物合成的競爭，研究團隊測試了四種不同類型的啓動子以探索動態調控下畢赤酵母中 ERG20 的轉錄水平，然而 HXT1p、GUT1p 和 GUT2p、ERG1p 和 ERG7p 的替換並未如預期提高荊芥醇的產量。相反，他們發現時間調節啓動子 CDC1p 的雜交版本（CDC1pA 和 CDC1pC）能有效動態調控 ERG20 的表達，在 YPD 培養基中使順反荊芥內酯產量比原始菌株 NEPC4 增加約 30%。此外，通過引入來自釀酒酵母的 ZWF1 和來自變形鏈球菌的 GAPN 來再生胞質 NADPH，結合 ERG20 的動態調控，他們成功將荊芥醇的滴度提高至 977.6 mg/L，比初始菌株提高了 21.8%。後來，團隊採用細胞質和過氧化物酶體的雙重調節策略來優化荊芥醇的生物合成。首先，在過氧化物酶體中引入 MVA 途徑和香葉醇生物合成途徑的酶，發現這增加了產量，但存在產物轉化效率低和細胞毒性大的問題。其次，通過將具有荊芥醇通路和過氧化物酶體香葉醇通路的單倍體菌株交配，構建了二倍體菌株 NEPC4/GERP12，進一步使產量達到 1124.4 mg/L。然而，高產量菌株的生長受到抑制，表明需要減輕產物積累帶來的細胞毒性。圖 | NEPC6P3和二倍體菌株NEPC4/GERP12的構建示意圖（來源：上述論文）
最後，他們在 5L 發酵罐中對性能最佳的二倍體菌株 NEPC4/GERP12 和胞質途徑菌株 NEPC7 進行了補料分批發酵。NEPC4/GERP12 在 70 小時內達到固定期，滴度達到 3861.0 mg/L，但生長速度較慢。而 NEPC7 生長和積累荊芥醇較快，70 小時達到 4429.4 mg/L 的最高滴度。圖 | (A)NEPC4/GERP12的補料分批發酵曲線;(B)NPEC7的補料分批發酵曲線
（來源：上述論文）
綜上所述，這項研究爲開發畢赤酵母細胞工廠提供了寶貴的借鑑經驗，併爲 MIAs 的可持續高效生產提供了良好的解決方案。1.https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1096717624000806免責聲明：本文旨在傳遞合成生物學最新訊息，不代表平臺立場，不構成任何投資意見和建議，以官方/公司公告爲準。本文也不是治療方案推薦，如需獲得治療方案指導，請前往正規醫院就診。
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