《自然—植物》：張秀任團隊重構植物miRNA生產圖譜並解析其精準剪切的原由
北京時間2024年6月25日17時，美國德州農工大學張秀任團隊在Nature Plants雜誌在線發表題爲“Parallel degradome-seq and DMS-MaPseq substantially revise the miRNA biogenesis atlas in Arabidopsis”的研究論文。
該研究創新性利用具有部分DCL1內切酶活性的顯性負突變體（dominant-negative mutant），結合降解組測序（Degradome-seq）及硫酸二甲酯突變分析與測序（DMS-MaPseq）技術，重新註釋了植物擬南芥體內 的miRNAs, 系統地揭示了其前體pri-miRNAs精準剪切圖譜及全基因組pri-miRNAs二級結構，進一步闡明瞭不同miRNAs剪切模式背後的序列結構決定因素。
上述研究成果不僅有助於釐清生理條件下 植物pri-miRNAs 精準剪切加工的原則及機制，爲設計更高效的artificial-miRNA 及作物育種提供新的理論依據，也爲開展其他作物及物種基因組重測序及miRNA註釋相關工作提供了重要借鑑。
非編碼核糖核酸（RNAs）是調控動、植物生長發育及環境適應性方面的關鍵調控元件。作爲關鍵的非編碼RNAs，microRNAs (miRNAs) 通過RISC複合體（RNA induced silencing complexes）誘導靶標mRNA降解以及抑制蛋白翻譯等轉錄後基因沉默（PTGS）途徑調控靶基因表達，廣泛參與調控細胞增殖、分化、凋亡、遷移、免疫應答、應激反應和代謝等多種生命活動【1-3】。經典的動物miRNA加工過程中，由RNase III核酸內切酶DROSHA及雙鏈RNA（dsRNA）結合蛋白DGCR8組成的microprocessor在細胞核內識別pri-miRNAs及其序列結構特徵（如UG 及CNNC motifs等），在距離莖環結構約11 個核苷酸（nt）的位置剪切產生約65 nt長度且在3’末端有兩個核苷酸凸出的pre-miRNA。後者運輸到細胞質中並在dsRNA結合蛋白TRBP協同作用下，經由另一種RNase III 核酸內切酶 DICER精準剪切加工形成成熟的miRNAs【4,5】。與之不同，植物miRNAs主要由RNase III核酸內切酶DCL1（Dicer-like 1）通過對具有髮卡結構的pri-miRNAs前體在細胞核內剪切加工而成。鋅指蛋白SE（Serrate）及dsRNA結合蛋白HYL1（hyponastic leaves 1）則參與調控miRNA剪切加工準確性和效率。
相較而言，植物pri-miRNAs 結構更爲複雜多樣且剪切過程均由DCL1在細胞核催化完成，這種瞬時及連續的剪切加工過程使得研究者難以精確捕捉體內條件下pri-miRNAs初始切割位點及真實的剪切加工模式，導致解析植物pri-miRNAs加工過程更爲困難。前期研究工作中，研究者對於植物pri-miRNAs 的剪切模式及其結構規則進行了探究，發現植物pri-miRNAs 的初始剪切位點通常發生在距單鏈RNA-雙鏈RNA銜接處或內部不配對區域（internal loops/bulges）約15-17nt處（15-17nt分子尺），且pri-miRNAs二級結構對於miRNAs剪切加工效率具有關鍵調控作用【6-9】。然而，多數植物pri-miRNAs並不具有此類參考位點且其剪切模式也存在多樣性，而基於預測推論出的絕大部分pri-miRNAs剪切加工模式真實性仍有待商榷。另一方面，現有的 pri-miRNAs二級結構數據主要是根據RNA序列固有的最小自由能預測而得，其在生理條件下真實的RNA二級結構 (RSS) 仍不清楚，而SE及HYL1調控體內pri-miRNAs二級結構及其精準剪切加工的功能仍有待釐清。
早期研究中，該團隊對植物pri-miRNA剪切加工機制進行了解析，發現DCL1 RNase III結構域中的1507和1696位E殘基對其發揮剪切活性至關重要。E1507Q和E1696Q是半活性的 DCL1突變體，它們僅參與切割pri-miRNAs雙鏈中的一條鏈，產生部分加工的pri-miRNAs中間體【9】。本研究工作中，研究人員構建了具有部分DCL1內切酶活性的顯性負突變體DCL1E1507Q和DCL1E1696Q，該突變體表現出DCL1功能缺失的發育表型，僅可對pri-miRNAs進行部分剪切。因此爲精確捕捉pri-miRNAs初始切割位點創造了條件，以此判斷相應的剪切模式和鑑定出真正pri-miRNAs。該遺傳材料是本課題堅實的理論基礎及創新點所在。利用上述材料，研究者首先通過Degradome-seq鑑定出147個真正的DCL1底物 ，這一數量相比於miRBase數據庫先前註釋的326個pri-miRNAs，極大程度勘正了限於測序技術及合適遺傳材料而不確定的結論。有意思的是，該研究發現81個pri-miRNAs 剪切並不依賴於DCL1，此外，仍有98個pri-miRNAs的真實性有待進一步研究。基於降解組測序捕獲的初始切割位點，研究者將147個依賴於DCL1剪切的pri-miRNAs的剪切模式系統分類整理爲五種，包括基部到環（BTL，37個）、連續的基部到環（SBTL, 16個）、 環到基部（LTB, 38個）、連續的環到基部（SLTB, 13個） 和雙向剪切模式（bidirectional, 43個）。上述研究結果不僅驗證了早期註釋的52個pri-miRNAs (35%) 的剪切模式，並重新註釋和報道了95個pri-miRNAs (65%) 的剪切模式，爲該領域後續的研究提供了極大的便利和參考價值。
同時，該研究通過優化的硫酸二甲酯突變分析與測序 (DMS-MaPseq)【10】技術系統地檢測了野生型及dcl1，se和hyl1突變體中的pri-miRNAs二級結構圖譜。通過對活體材料中可檢測到的73個pri-miRNAs二級結構進行解析，發現其中約95%的pri-miRNAs二級結構與計算機模擬預測結構均存在不同程度差異。上述植物全基因組pri-miRNA二級結構圖譜清晰地闡明瞭困擾科學家們的關於pri-miRNA 的初始切割位點及其剪切模式問題，表明除經典的衡量切割位點的15-17nt分子尺之外，部分pri-miRNAs廣泛存在距離初始切割位點約9-11 nt的internal loops/bulges，其可能是DCL1 識別並精準剪切pri-miRNA新的參照位點。在此基礎上，本研究還發現DCL1傾向於在pri-miRNA不配對的區域進行初始切割，且SE和 HYL1可單獨或協同作用調控pri-miRNA精準剪切及其二級結構。整體而言，該研究通過Degradome-seq和DMS-MaPseq聯合分析，提供了全基因組水平植物體內pri-miRNAs精準剪切加工及體內二級結構圖譜，勘正了此前由於遺傳材料和測序策略的限制而得到的一些不確切的結論，爲解析植物miRNA合成機制提供了新的思路。
植物全基因組pri-miRNA精準剪切加工及二級結構圖譜
德州農工大學農業與生命科學學院博士研究生嚴星星和博士後李長昊爲論文共同第一作者，張秀任教授爲論文通訊作者。海南大學劉開業教授，合肥工業大學曹樹青教授及德州農工大學Peng Xu教授和James J. Cai教授等爲本工作提供了重要的指導和幫助。該研究得到了美國NIH (NO. R35GM151976)，NSF MCB (NO. 2139857)及Welch Foundation (NO. A-2177-20230405) 等項目的資助。
張秀任教授團隊主要從事RNA生物學相關工作，在植物非編碼RNA合成及表觀遺傳沉默機制、RNA二級結構形成以及病毒-宿主互作等研究領域取得了系列突破性成果。張秀任教授任德州農工大學Chancellor EDGES, Presidential Impact Fellow, Christine Richardson Endowed 教授，主持多項NSF（包括傑出研究者基金）及NIH R01 和R35科研項目並長期擔任美國國立衛生院 (NIH), 美國國家自然科學基金委 (NSF) 評審委員會成員，擔任多個國際頂級期刊審稿人。該團隊目前已開放多個職位，歡迎感興趣的博士後和研究生申請加入。
相關論文信息：
https://www.nature.com/articles/s41477-024-01725-9
參考文獻
編輯 | 餘 荷
欲知更多內容，敬請圍觀小柯機器人頻道：
