氮循環微生物怎麼做？做什麼？一文囊括！

2024-06-25 17:03
聯川生物

圖1 微生物相關氮循環過程^[1]

氮元素是所有生物體必不可少的元素，是關鍵細胞成分（如蛋白質和核酸）生物合成所必需的，而空氣中佔比70%以上的N₂是最大的可自由利用氮庫存，除稀有但高度多樣化的固氮微生物，其它生物必須依靠更具反應性的氮形式生長，例如銨或硝酸鹽^[1]。由此，氮元素爲限制性營養元素，而這一元素的可用性主要由改變氮氧化狀態的微生物反應控制。當微生物氮循環網絡受到影響會減弱或加劇由人類引起的全球變化，例如溫室氣體N₂O的生成和去除均由微生物介導。

因此，微生物是氮元素地球化學循環中不可缺少的一個環節，並在其中起着重要作用。

1. 微生物與氮循環研究熱點

(1) 環境微生物氮循環及其環境效應：例如不同植被類型下土壤微生物介導的氮循環功能差異及其對N₂O溫室氣體排放影響等；

(2) 氮循環與其它元素循環耦合：例如碳-氮循環交互作用，微生物氮循環-鐵循環耦合作用等；

(3) 微生物氮循環功能發掘：通常採用宏基因組研究，例如人類活動對土壤-河流-河口連續體氮循環功能微生物影響等。

(4) 微生物交互及與宿主結合的多生態位研究：通常通過多組學研究進行，例如，植物代謝物對微生物影響介導土壤氮循環變化，細菌-真菌競爭作用介導不同土壤類型氮循環變化等。

2. 氮循環微生物研究方法

氮循環涉及基因數量多，相較於16S的預測基因不準確性，功能基因擴增的引物冗餘性，宏基因組方法的優勢日益凸顯，此次聯川也針對氮循環推出了新的數據庫NCycDB，NCycDB（https://github.com/qichao1984/NCyc）是針對氮元素循環的專用數據庫，於2019年建立，共收錄68個基因家族，涵蓋8個N循環過程。相較於通用數據庫，NCycDB更具有針對性，可快速實現對氮循環基因的註釋和分析。

3. 微生物與氮循環研究方案

圖1 微生物與氮循環通用研究方案技術路線圖

取樣樣本：如上圖，通常設置不同濃度，不同處理方式，取環境樣本（水、土壤等）、植物、動物等樣本進行組學檢測。

生物學重複：≥5個（考慮個體差異性存在，可適當增加每組生物學重複數目）。

典型案例1：污泥堆肥中蚯蚓的存在改變了微生物羣落從而介導了碳、氮元素週轉變化，並增強整體生物穩定性

英文標題：How do earthworms affect the pathway of sludge bio-stabilization via vermicomposting?^[2]

發表期刊：Science of the Total Environment（IF：9.8）

發表時間：2024.01

樣本類型：市政污泥蚯蚓堆肥

組學技術：16S rDNA測序（V3-V4）+18S rDNA測序（V4-V5）

圖2 文章技術路線圖

研究內容：蚯蚓堆肥系統中，蚯蚓與微生物的協同作用可促進氮的礦化並增強有機物的穩定性，但蚯蚓堆肥在系統中的穩定途徑仍然未知。本篇文章的研究目的是研究蚯蚓對污泥堆肥中微生物種羣及其中碳氮物質週轉的影響。在 20℃下對市政污泥進行60天的堆肥處理，兩個系統中的有機物 (OM)、溶解有機碳 (DOC)、NH₄⁺-N、電導率 (EC)、微生物生物碳 (MBC) 和脫氫酶活性 (DHA) 隨時間的變化趨勢相似。對於系統的理化評估發現，在處理結束時，蚯蚓堆肥組的OM和DOC 顯著低於對照組（p<0.05），EC、NH₄⁺-N和NO₃-N 顯著高於對照組（p<0.05）。

根據主成分分析（PCA），提出了關於蚯蚓堆肥過程中微生物驅動碳、氮元素週轉的潛在機制。蚯蚓堆肥處理的原核微生物種類丰度和多樣性高於對照組，但微生物羣落組成分佈更均勻，真核微生物的表現則相反。蚯蚓堆肥提高了參與有機物降解和硝化作用的微生物丰度，促進了有機物的轉化，有利於硝化作用的進行。

圖3 蚯蚓堆肥污泥過程種氮相關轉化的潛在機制

典型案例2：鉛鋅廢棄礦區自然演替過程下環境中微生物介導的碳氮磷循環變化

英文標題：Changes in soil microbe-mediated carbon, nitrogen and phosphorus cycling during spontaneous succession in abandoned Pb–Zn mining areas^[3]

發表期刊：Science of the Total Environment（IF：9.8）

發表時間：2024.04

樣本類型：土壤

組學技術：宏基因組

圖4 文章技術路線圖

研究內容：土壤微生物在礦山廢棄地恢復過程中介導碳和其它營養元素循環的機制尚不清楚。本篇文章通過土壤宏基因組測序手段，研究了典型的鉛鋅廢棄礦山從生物土壤結皮（Biological soil crust,BSC）向闊葉混交林（Mixed broad-conifer forest,MBF）演替過程中土壤微生物潛在地球化學循環功能的動態變化。結果表明，在演替過程中，土壤微生物有利於通過厭氧和微好氧途徑進行碳封存，控制碳降解和有氧呼吸的基因分別增加了19.56%和24.79%，反映了演替期間土壤微生物碳循環相關基因的動態變化。對於氮循環，土壤微生物介導的氮循環基因在演替早期達到最高，導致淨潛在硝化速率和總氮含量分別增加了75.29%和76.81%。Mantel相關性分析表明，TOC、TN、Zn 和 Cd 含量是影響土壤碳和磷循環的主要土壤環境因子。土壤AP含量成爲與氮循環相關的基因的主要影響因素。本次研究結果揭示了廢棄Pb-Zn礦演替過程中的微生物動態功能，爲生物地球化學循環機制提供了見解，並強調了土壤性質中環境因子是影響礦區土壤生物地球化學過程的關鍵因素。

圖5 CNP循環基因與土壤因素相關的RDA分析

典型案例3：微生物組研究揭示土壤殘留微塑料膜的“塑料際”對土壤元素循環的潛在危害

英文標題：Farmland Microhabitat Mediated by a Residual Microplastic Film: Microbial Communities and Function^[4]

發表期刊：Environment Science&Technology（IF：11.4）

發表時間：2024.02

樣本類型：土壤，微塑料薄膜

組學技術：16S rDNA測序（V3-V4）+ITS rDNA測序（ITS1）+宏基因組測序

圖6 文章技術路線圖

研究內容：農田殘留微塑料膜介導的塑料際如何影響微生境系統尚不清楚。本篇文章通過16S rDNA擴增子測序和ITS及宏基因組分析，分析了33個典型農田地點塑料圈和土壤的微生物羣落組成結構、組裝和生物地球化學循環功能基因。結果表明，殘留微塑料膜被微生物定殖，形成一個獨特的生態位，即塑料際，且土壤和塑料際的微生物羣落結構和功能存在顯著差異。殘留微塑料膜改變了微生物的共生和組裝過程，塑料際和土壤中細菌羣落的組裝顯著受隨機過程支配，塑料際的真菌羣落組裝也是受隨機過程支配，而土壤中真菌羣落的組裝受確定性過程支配。此外，殘留微塑料膜形成的塑料際是與塑料降解和氮硫循環相關的病原菌和微生物的首選載體，塑料圈中與反硝化作用和硫酸鹽還原活性相關的基因丰度明顯高於土壤，增加了氮硫流失的潛在風險，研究結果將爲科學認識殘留微塑料膜對農田的危害提供參考。

圖7 基因丰度和微生物（門水平）對土壤（n =12）和塑料際（n =12）中氮和硫循環的貢獻。（A）氮循環，氮固定（黑色），硝化作用（紅色），厭氧氨氧化（橙色），反硝化作用（藍色）；（B）硫循環，硫氧化過程（藍色），同化硫酸鹽還原過程（黑色），異化硫酸鹽還原和氧化（紅色），硫固定（橙色）；（C和D）基於Wilcoxon秩和檢驗的土壤和塑料圈中與氮循環（C）和硫循環（D）相關的基因相對丰度（p <0.05）；（E和F）殘留微塑料膜對農田中氮（E）和硫（F）循環過程影響的示意圖（*：p <0.05）

典型案例4：微生物組學和共生實驗揭示氮營養狀況和根瘤產生的Nod因子是影響固氮植株根際微生物組裝和固氮能力的重要因素

英文標題：Nitrogen and Nod factor signaling determine Lotus japonicus root exudate composition and bacterial assembly^[5]

發表期刊：Nature Communications（IF：16.6）

發表時間：2024.04

樣本類型：土壤、根際、根、根瘤

組學技術：16S rDNA測序（V5-V7）+非靶代謝組（根系分泌物）

圖8 文章技術路線圖

研究內容：與土壤中固定大氣氮的細菌共生使豆科植物能夠在缺氮土壤中生長，共生會影響根部微生物羣的組裝，但目前尚不清楚豆科植物宿主與根瘤菌之間的相互作用如何影響剩餘的微生物羣，以及它是否依賴於氮營養。此篇文章通過使用植物和突變體研究 Nod 因子信號對日本蓮花（Lotus japonicus )根部微生物羣組裝的作用。通過16S r DNA和非靶代謝研究發現，共生體會產生Nod因子來激活宿主中的Nod 因子信號，這會調節根系分泌物譜和共生根部微生物羣的組裝。具有不同共生能力的蓮花植物在未施肥或補充硝酸鹽的土壤中生長，表現出三種氮依賴性營養狀態：飢餓、共生或無機。在不同的氮營養狀態下，根和根際微生物羣在組成和連通性上有所不同，表明共生和無機氮對豆科植物根部微生物羣的影響不同。最後，通過機器學習預測，建立了具有高度準確的預測植物氮營養狀況的細菌羣落。

圖9 根瘤共生期間的氮營養和信號傳導影響羣落組裝。

（左）無機氮存在下生長的植物會分泌特定代謝物並組裝具有低連通性的微生物羣落。

（右）在共生允許條件下生長的植物會分泌黃酮類化合物等代謝物（1）代謝物誘導固氮根瘤菌產生Nod因子（2）Nod因子被宿主識別，啓動信號通路（3）適應共生體，共生活性根根系分泌物隨不同條件變化（4）相關微生物羣落，與影響宿主以促進共生關聯和植物生長（5）仍有待確定

典型案例5：宏基因組研究探明植物生物質的加入增強鐵基生態浮牀微生物反硝化作用的鐵-氮耦合代謝機制

英文標題：Simultaneously enhanced autotrophic–heterotrophic denitrification in iron-based ecological floating bed by plant biomass: Metagenomics insights into microbial communities, functional genes and nitrogen metabolic pathways^[6]

發表期刊：Water Research（IF：12.8）

發表時間：2023.12

樣本類型：反應器表面

組學技術：宏基因組

圖10 文章技術路線圖

研究內容：本篇研究構建了負載零價鐵（ZVI）和植物生物質的生態浮牀（EFB-IB）來提高低污染水體的脫氮效果，通過宏基因組測序分析了ZVI與植物生物質耦合對微生物羣落結構、代謝途徑和功能基因的影響，揭示了其脫氮機制。結果表明，與單一ZVI系統（EFB-C）相比，EFB-IB有效提高了反硝化效率，平均NO₃-N去除效率提高了22.60～59.19%，平均NH₄⁺-N去除效率提高了73.08～91.10%。宏基因組分析表明，EFB-IB富集了參與鐵循環、木質纖維素降解和氮代謝的微生物。植物生物質的添加同時提高了自養和異養反硝化細菌的相對丰度。網絡分析表明EFB-IB中自養與異養反硝化細菌之間存在協同作用;此外，與EFB-C相比，植物生物質的添加提高了與鐵循環、木質纖維素降解和糖酵解過程相關的基因相對丰度，保證了自養和異養電子供體的產生。因此，EFB-IB中反硝化相關的關鍵酶和功能基因的相對丰度較高，有利於NO₃ -N的去除。此外，脫氮和功能基因的相關性分析驗證了EFB-IB中鐵基自養反硝化和植物生物質介導的異養反硝化的協同機制。總之，植物生物質對提高低污染水體鐵基EFB的脫氮效果有很好的潛力。

圖11功能基因與脫氮性能的Spearman相關性分析（a）；物種對功能基因的貢獻（b）；ZVI和植物生物量增強反硝化的可能機制（c）

表1 聯川微生物2023年項目文章節選

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參考文獻

[1] Kuypers M M M, Marchant H K, Kartal B. The microbial nitrogen-cycling network[J]. Nature Reviews Microbiology, 2018, 16(5): 263-276.

[2] Lei X, Cui G, Sun H, et al. How do earthworms affect the pathway of sludge bio-stabilization via vermicomposting?[J]. Science of The Total Environment, 2024, 916: 170411.

[3] Wang S, Yuan X, Li T, et al. Changes in soil microbe-mediated carbon, nitrogen and phosphorus cycling during spontaneous succession in abandoned PbZn mining areas[J]. Science of The Total Environment, 2024, 920: 171018.

[4] Li Z, Feng C, Lei J, et al. Farmland Microhabitat Mediated by a Residual Microplastic Film: Microbial Communities and Function[J]. Environmental Science & Technology, 2024, 58(8): 3654-3664.

[5] Tao K, Jensen I T, Zhang S, et al. Nitrogen and Nod factor signaling determine Lotus japonicus root exudate composition and bacterial assembly[J]. Nature Communications, 2024, 15: 3436.

[6] Peng Y, Gu X, Zhang M, et al. Simultaneously enhanced autotrophic–heterotrophic denitrification in iron-based ecological floating bed by plant biomass: Metagenomics insights into microbial communities, functional genes and nitrogen metabolic pathways[J]. Water Research, 2024, 248: 120868.