江蘇大學雍陽春團隊Angew. Chem.:活細胞點擊化學實現微生物種間電子傳遞
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近日,江蘇大學能源研究院/生物質能源研究院雍陽春團隊在《Angewandte Chemie International Edition》雜誌發表了題爲“Unnatural Direct Interspecies Electron Transfer Enabled by Living Cell-Cell Click Chemistry”的研究論文。文中以希瓦氏菌(S. oneidensis,SO)和沼澤紅單胞菌(R. palustris, RP)爲典型模型,通過點擊化學(Click Chemistry)的細胞-細胞間距工程建立了非天然的直接種間電子轉移(DIET)雙菌體系,展示了自然條件無法實現的DIET。該研究爲DIET調控提供了一種高效、直接的途徑,這將擴展我們對DIET的理解,爲天然DIET途徑的發掘和應用開闢新的途徑。
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引言
不同種屬細菌細胞之間的電子傳遞過程是微生物能量代謝新興過程,直接種間電子轉移(DIET)是其中最重要的一種細胞間電子傳遞模式。DIET對於維持微生物羣落功能、驅動地球元素循環和污染物轉化至關重要,已成爲環境和地學領域研究的國際前沿。但是,DIET如何發生及如何調控一直是困擾這一領域的、懸而未決的關鍵基礎科學難題。據此,研究團隊以希瓦氏菌(S. oneidensis,SO)和沼澤紅單胞菌(R. palustris, RP)爲典型模型,通過點擊化學(Click Chemistry)的細胞-細胞間距工程建立了非天然的DIET雙菌體系,該策略爲SO和RP搭建“鵲橋”,使“牛郎”菌(SO)終與“織女”菌(RP)相會,實現了不同種屬細胞之間分子尺度的特異性直接鏈接。基於SO菌與RP菌分子尺度的有效鏈接,該研究在國際上率先實現了希瓦氏菌細胞外膜C型細胞色素直接參與的DIET,證實了“細胞間距”是決定細胞外膜C型細胞色素DIET的關鍵因素的科學假說。同時,該研究還實現了SO菌與RP菌之間電子傳遞模式H2介導的間接電子傳遞(MIET)向DIET的直接轉換,證實了“細胞鵲橋工程”的可行性,爲DIET過程的人工創建和調控提供了新的借鑑和思路。
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圖文導讀
利用Click Chemistry方法在活細胞SO和RP之間建立共價連接
圖1:(a) 活細胞-細胞點擊化學的示意圖。Cyto C代表C型細胞色素。(b) AZDye 488 DBCO染色的疊氮修飾的SO的CLSM圖像。(c)
Cy5-疊氮染色的炔基修飾的RP的CLSM圖像。(d) 在不同條件下的細胞聚集形成情況。click表示具有點擊連接的SO和RP;mix表示簡單混合的SO和RP。照片顯示了在45分鐘超聲分散前(上)和之後(下)帶有Click或簡單混合(Mix)的細胞。(e)在不同點擊反應時間後,使用AZDye 488 DBCO染色的SO和RP的熒光強度。
首先,在SO與RP的細胞外表面引入炔基或疊氮修飾的單糖。通過對應的炔基和疊氮基團熒光染料驗證細胞表面對應基團修飾情況,實驗結果表明炔基和疊氮基團已成功修飾在細胞表面(圖1b-c)。接下來,使用修飾完的細胞進行Click連接,通過肉眼直接觀察到了SO與RP通過Click連接形成團聚體沉澱在培養管中(圖1d)。進一步實驗發現,隨着Click時間的延長,疊氮熒光染料染色產生的細胞熒光逐漸減弱(圖1e),這表明修飾SO上的遊離疊氮基團逐漸被修飾RP的炔基團阻斷,從而證明SO與RP之間的細胞-細胞Click是成功的,並表明建立了細胞-細胞Click連接。
細胞-細胞共價連接可視化表徵
圖2:(a-c) 對簡單混合後的FISH標記的SO和RP的CLSM圖像。RP被用Cy3標記的探針標記(紅色),而SO被用FITC標記的探針標記(綠色),比例尺爲20μm。(d) 從(c)中顯示的合併圖像計算的熒光比例。(e-g) 對點擊連接後的FISH標記的SO和RP的CLSM圖像。RP被用Cy3標記的探針標記(紅色),而SO被用FITC標記的探針標記(綠色),比例尺爲20μm。(h) 從(g)中顯示的合併圖像計算的熒光比例。(g)的插圖顯示了所選區域的放大視圖。(i) 點擊連接後的SO和RP的TEM圖像,(j) 點擊連接的Pd標記的SO(細胞表面的黑點是Pd納米顆粒)和原生RP的TEM圖像,(k) (j)中所選區域的放大視圖。(l) SO和RP之間點擊化學連接後的細菌細胞活力(用LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit染色;綠色熒光表示活細胞,紅色熒光表示死細胞)。
利用熒光原位雜交(FISH)和TEM對Click反應後SO與RP細胞之間形成的特異性直接鏈接進行了表徵。在FISH分析中,簡單混合(Mix)的SO和RP相互分離,幾乎沒有物理接觸,僅有3%比例的細胞發出連接後的黃色熒光。相比之下,Click組出現了明顯的細胞聚集,發出連接後的黃色熒光的細胞比例高達81%(圖2i)。此外,TEM觀察證實,Click後SO和RP細胞之間實現了高度緊密連接(圖2i-k)。接下來利用SO的生物礦化能力進一步區分了SO和RP,可以清楚地觀察到表面標記有Pd納米顆粒的SO和RP細胞在並排模式下緊密相連(圖2j-k)。
黑暗厭氧條件下SO和RP共培養體系的產甲烷性能
圖3:(a)不同共培養體系的甲烷產生和(b)甲酸鹽代謝。
接下來,根據該雙菌共培養系統的設計原則,以甲烷產量作爲種間電子傳遞(IET)效率的指標。其中額外在Mix組中加入陽離子聚合物(聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDAD))促進細胞聚集以進一步評估細胞聚集對IET的影響(PDAD組)。在進行了Click連接後的SO和RP細胞的甲烷產量很高,達到了1.8 nmol,是Mix組的6倍(圖3a)。同時,底物(甲酸)的利用率也證實Click組的新陳代謝速度快於Mix組(圖3b)。此外,Mix組和PDAD組計算得出的甲烷產率(nmol甲烷產量/mmol甲酸消耗量)均爲0.04,而Click組的甲烷產率爲0.09,是Mix組和PDAD組的2.25倍。這些結果證明,Click所建立的細胞-細胞連接大大提高了SO和RP之間的電子傳遞效率。
SO和RP共培養產甲烷體系的電子傳遞機制
圖4:不同共培養體系在(a)氫化酶產氫抑制劑(甲醛)和黃素分泌突變(SO(Δbfe)菌株)作用下,(b)電子傳遞抑制劑,(c)氫化酶突變體(SO(ΔhydA/ΔhyaB))和電子傳遞抑制劑,以及(d)電子傳遞鏈蛋白突變和氫化酶抑制劑對不同共培養體系甲烷產生的影響。
由於Click組相較於Mix組大大提高的電子傳遞效率,推測雙菌體系中的DIET可能被激活。接下來,對Mix與Click體系中的IET路徑類型進行了研究。當阻斷Mix與Click組中的H2介導的MIET時,Mix組中的甲烷產量下降到了0.09 nmol(甲醛)與0.08 noml(SO氫化酶敲除菌),而Click組甲烷產量受到的影響沒有統計學意義(p>0.05)(圖4a, 4c)。並且通過SO黃素分泌突變株排除了其他電子穿梭體介導的MIET的可能性,證實了H2介導的MIET是Mix組的主要IET途徑,並表明其他IET途徑而不是H2介導的MIET途徑在有Click組中起主導作用(圖4a)。接着,通過阻斷Mix與Click組中的DIET,發現Mix組中的甲烷產量受到的影響沒有統計學意義(p>0.05),而Click組甲烷產量下降到了0.28 noml(魚藤酮與辣椒素),0.27 nmol(雙香豆素)與0.25 noml(SO (ΔmtrC /omcA)),均被抑制了80%以上,這說明DIET是Click組中IET的主要途徑(圖4b, 4d)。
圖5:通過活體細胞-細胞點擊化學方法,從MIET轉向DIET的IET途徑的示意圖
最後,結合以上實驗結果進一步證實了SO和RP之間由細胞外表面C型細胞色素介導的DIET是可以通過活細胞-細胞Click建立的。因此,通過Click建立共價配體後,SO和RP細胞高度接近地連接在一起,從而使SO和RP細胞之間的C型細胞色素緊密接觸。在這種情況下,可能會建立一條之前從未被發現過的以SO爲電子供體菌株的DIET電子傳遞鏈(電子通過SO中的MtrCAB/OmcA流向RP中潛在的C型細胞色素)。基於這一條人工建立的DIET路徑實現了SO菌與RP菌之間電子傳遞模式H2介導的間接電子傳遞(MIET)向DIET的直接轉換(圖5)。雖然SO被認爲是一種富含外膜C型細胞色素的電活性菌,但以SO爲電子供體菌株的DIET之前從未被實現過。
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小結
本研究爲細胞外膜C型細胞色素介導的DIET提供了直接證據,預示自然界中可能存在更爲精巧的DIET途徑,爲種間電子傳遞機理研究開拓了新的思路。此外,這種簡單的細胞-細胞間距工程學思想還能爲DIET精細調控提供新的靈感,爲DIET在生物工程、環境和健康等各個領域的應用鋪平道路。
本研究得到了國家重點研發計劃、江蘇省雙碳科技專項和國家自然科學基金的資助。
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作者簡介
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