梯度洗脫 VS 等度洗脫

在反相色譜和離子交換色譜中，如果成功分離的條件不明，通常會進行梯度分離。這種梯度分離是從 10% 到 100% 的 B 溶劑（強溶劑），以線性曲線進行。(如前所述，在反相色譜中通常不推薦使用 100% 的流動相 A，因爲鍵合烷基鏈會塌陷）。

決定以等度模式還是梯度模式進行分離的步驟如下：

如果色譜峯佔梯度分離時間的 25%以上，則梯度分離效果更好，甚至是唯一的可能；但是，%B 跨度可以小於 10%到 100%。假設的色譜峯模式如圖 1 上半部分所示。
如果色譜峯所佔梯度時間少於 25%（圖 1 下半部分），則應嘗試等度分離。可從色譜圖中估算出 B 組分的有利比例。

如果同時存在上述兩種情況，通常需要尋找最佳選擇性（固定相類型、B 溶劑、流動相添加劑、溫度）來優化分離。梯度本身也必須經過優化，使流動相的強度在開始時足以洗脫保留最弱的分析物。之後，通過增加強溶劑的用量來改變流動相的組成，以洗脫保留較強的分析物。圖 2 顯示了 17 種氨基酸的分離過程。（注意，此時現在採用了適當的梯度程序。）

%B 的變化可以是線性的、組成線性的、凹形的或凸形的，如圖3所示。

如果第二種分析物所需的洗脫強度遠大於第一種分析物，凹梯度就很有用。在這種情況下，只需添加少量的 B，流動相的洗脫強度就會發生很大的變化。

某些情況下，梯度運行時會出現鬼峯。原因在於梯度洗脫的所有溶劑都必須非常純淨，否則流動相 A（或 B）中的微量雜質可能會吸附在色譜柱頂部，隨後被流動相 B 洗脫，導致出現鬼峯。圖 4 舉例說明了這一點。在不進樣的情況下，在 10 分鐘內運行了 20 ~ 100%B 的梯度（隨後 100%B 等度）。

條件如下：流動相 A：純水；流動相 B，乙腈（默克公司，pro analysi）；流速，1 mL/min；固定相，Spherisorb ODS，5 mm；色譜柱，250 mm × 3.2 mm (ID)；檢測器，UV 254nm。結論：使用的乙腈或水純度不夠！

必須根據經驗確定合適的梯度（涉及的溶劑、梯度之間的間隔時間、梯度輪廓的形狀），可以遵循某些規則或藉助計算機輔助。

梯度分離的缺點是：必須在梯度運行後對色譜柱進行再平衡。不過，對於採用化學鍵合相的色譜柱來說，這一點相對簡單，只需泵送五倍於柱體積的起始流動相即可再次進樣。另外，使用梯度分離時請注意儀器的死體積。

此外，如前所述，梯度洗脫通常不推薦用於吸附柱，也不適合示差折光檢測器和電導檢測器。

文章來源：儀器小知識

責任編輯：展源

審覈人：何發