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Piezo1 channel exaggerates ferroptosis of nucleus pulposus cells by mediating mechanical stress-induced iron influx

作者：Ziqian Xiang,Pengfei Zhang,Chunwang Jia, Rongkun Xu, Dingren Cao, Zhaoning Xu, Tingting Lu, Jingwei Liu, Xiaoxiong Wang, Cheng Qiu, Wenyang Fu, Weiwei Li, Lei Cheng, Qiang Yang, Shiqing Feng, Lianlei Wang,corresponding author Yunpeng Zhao,corresponding author and Xinyu Liu

發表情況：Bone Res.2024 Mar 29.

DOI:10.1038/s41413-024-00317-9

科學問題

1.多細胞生物中的細胞永久暴露於機械應力，產生和響應機械應力的能力對細胞行爲和生命活動至關重要，然而，機械轉導（細胞將機械信號轉化爲化學信號的機制）的詳細機制仍未完全瞭解；

2.研究確定硬性細胞外基質在Piezo1激活中的潛在作用；

3.闡明Piezo1通道在椎間盤（IVD）和髓核細胞（NPCs）鐵死亡中的功能；

重要發現

1. Piezo1通道的激活導致細胞內鐵過載，最終以應激反應方式導致鐵死亡。

2. Piezo1通道的激活以TFRC非依賴性的方式直接介導鐵內流，這可能發生在早期階段，並伴有TFRC的反饋下調。

3. Piezo1或其抑制劑GsMTx4的缺失可以逆轉鐵過載，Piezo1-鐵鐵死亡軸可能是機械應力誘發疾病的一種新治療方法。

中文摘要

迄今爲止，已經發現了幾種促進鐵內流的分子，而鐵內流通道的類型仍有待闡明。在這裏，Piezo1通道被確定爲響應機械應力的關鍵鐵轉運蛋白。壓電介導的鐵超載干擾了髓核細胞(NPCs)的鐵代謝和鐵凋亡。重要的是，piezo1誘導的鐵內流獨立於轉鐵蛋白受體(TFRC)，這是一個公認的鐵看門人。此外，Piezo1的藥理失活顯著減少了鐵的積累，減輕了線粒體ROS，並抑制了機械應力刺激下的鐵的變化。此外，條件敲除Piezo1 (Col2a1-CreERT Piezo1flox/flox)可減輕機械損傷誘導的椎間盤退變(IVDD)。值得注意的是，在Piezo1/Gpx4條件雙敲除(cDKO)小鼠(Col2a1-CreERT Piezo1flox/flox/Gpx4flox/flox)中，Piezo1缺乏對IVDD的保護作用被抑制。這些發現表明，Piezo1是鐵內流的潛在決定因素，表明Piezo1-鐵-鐵下垂軸可能有助於機械應力誘導疾病的治療。

英文摘要

To date, several molecules have been found to facilitate iron influx, while the types of iron influx channels remain to be elucidated. Here, Piezo1 channel was identified as a key iron transporter in response to mechanical stress. Piezo1-mediated iron overload disturbed iron metabolism and exaggerated ferroptosis in nucleus pulposus cells (NPCs). Importantly, Piezo1-induced iron influx was independent of the transferrin receptor (TFRC), a well-recognized iron gatekeeper. Furthermore, pharmacological inactivation of Piezo1 profoundly reduced iron accumulation, alleviated mitochondrial ROS, and suppressed ferroptotic alterations in stimulation of mechanical stress. Moreover, conditional knockout of Piezo1 (Col2a1-CreERT Piezo1flox/flox) attenuated the mechanical injury-induced intervertebral disc degeneration (IVDD). Notably, the protective effect of Piezo1 deficiency in IVDD was dampened in Piezo1/Gpx4 conditional double knockout (cDKO) mice (Col2a1-CreERT Piezo1flox/flox/Gpx4flox/flox). These findings suggest that Piezo1 is a potential determinant of iron influx, indicating that the Piezo1-iron-ferroptosis axis might shed light on the treatment of mechanical stress-induced diseases.

圖片摘要：鐵代謝模式示意圖。

a. 正常情況下細胞的鐵代謝模式。

b. 機械應力下細胞鐵代謝模式。

結果

圖一：Piezo1通道導致鐵在機械應力下過載。

a. 機械刺激裝置示意圖。

b. 在1 MPa機械應力下用不同藥物處理細胞示意圖(n = 3)。

c. NPCs中不同基因表達的熱圖。

d. 1 MPa機械應力下差異表達基因的火山圖。

e/f. 在1MPa機械應力下，GO a KEGG氣泡圖顯示了不同的路徑。

g. GSEA分析顯示金屬離子轉運 和脂質途徑調控的變化。

h. 用FerroOrange 和相對平均熒光強度（MFI）的定量分析（n = 3）檢測在不同時間點應激處理後的 NPC 細胞內Fe2+。

i. 1 MPa 機械刺激後不同時間的鐵代謝標誌物（TFRC、FPN、DMT1 和 FTH1）和鐵死亡標誌物（ACSL4、FSP1和 GPX4）的蛋白質印跡分析（n = 3）。

j. 用鐵測定試劑盒測定不同時間點細胞內Fe2+含量(n = 3)。

k. 在1MPa的機械刺激下，分別用GsMTx4或Fer-1處理npc 6、12、24、36、48和72 h (n = 3)。

l. GsMTx4或Fer-1在1MPa機械刺激下對大鼠npc的形態學影響。

m. 使用Actin Tracker Kit觀察npc細胞骨架。

n/o. 定量分析加GsMTx4或不加GsMTx4作用於1MPa機械應力24h的npc細胞內相對Fe2+和MDA含量(n = 3)。

p. 24h不同處理的npc細胞內Fe2+的檢測及相對MFI的定量分析(n = 3)。

q/r. 細胞死亡/活分析顯示npc的細胞死亡率(n = 3)。

s/t. GsMTx4或不加GsMTx4處理後AFCs、BMSCs和MC3T3-E1在1 MPa機械應力作用下的代表性形態學變化(n = 3)。

所有數據均表示爲平均值±SEM, n = 3個重複，每3個獨立實驗中有一個代表性。ns(無統計學意義)，*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001

圖二：機械應力通過 Piezo1 激活影響鐵死亡。

a. 在機械應力1MPa作用下，GsMTx4或Fer-1 24h的npc細胞內在無Ca2+介質中ROS的檢測。使用DCFH-DA和定量分析相對MFI (n = 3)。

b. 不同刺激處理24h的npc的代表性透射電子顯微鏡（TEM）圖像。箭頭表示線粒體萎縮。比例尺，20 μm(低場)，5 μm(高場)。

c. 使用Mitotracker Kit檢測線粒體功能。

d. 加GsMTx4或不加GsMTx4的npc在1MPa機械刺激24 h後線粒體功能標記物OPA1、Mfn2、Mfn1和DRP1的WB分析和定量。用GAPDH作爲內對照(n = 3)。

e. JC-1測定顯示NPC的線粒體膜電位，JC-1單體染成綠色，JC-1聚集體染成紅色。

f. NPCs的鐵代謝標誌物和鐵死亡基因的WB分析。

g. 在1 MPa機械刺激24h下，用或不用GsMTx4處理的NPCs的鐵代謝基因Tfrc、Fpn、Fth1和鐵死亡基因Acsl4、Fsp1、Gpx4的PCR分析和定量（n = 3）。

h. 在1 MPa機械刺激下用或不用Fer-1 處理 24 小時的 NPC 的鐵代謝標誌物和鐵死亡標誌物的 WB 分析（n = 3）。

i/j. 相對MFI的定量分析（n = 3）。

k. 氧化BODIPY-C11熒光的代表性直方圖。

l. 使用BODIPY-C11在1 MPa機械刺激下，用或不用 GsMTx4 處理 24 小時的NPC 中的脂質ROS。

所有數據均以均數±SEM表示，n = 3個重複，每3個獨立實驗中有一個代表。ns(無統計學意義)，*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001

圖三：Piezo1通道的藥理激活顯著增加鐵過載。

a. 在高鐵環境下用Piezo1激動劑Yoda1或抑制劑GsMTx4處理的細胞示意圖。10 μmol/L Yoda1在無Ca2+培養基中處理24 h大鼠NPCs的RNA測序分析(n = 3)。

b. NPCs的圓圈圖分析。

c. 用Yoda1處理的NPCs差異表達基因的火山圖。

d. 顯示npc不同基因表達的芯片熱圖。

e/f. 在NPC中GO和KEGG氣泡圖分析。

g. GSEA 分析顯示對機械刺激和鐵離子穩態途徑的反應調節變化。

h. FAC的化學結構。

i. 在 100 μmol/L FAC 中用 Yoda1 或GsMTx4 處理 24 小時的 NPC 的代表性形態變化。

j. Actin Tracker Kit顯示NP細胞骨架的變化。

k. 細胞內Fe2+的檢測使用FerroOrange和相對MFI的定量分析（n = 3）。

l/m. 定量分析高鐵環境下Yoda1或GsMTx4處理或不處理NP細胞24 h後,細胞內相對Fe2+和MDA含量(n = 3)。

n. 通過細胞死亡/活分析測細胞死亡比率（n = 3）。

o. NPC 用不同藥物處理 6、12、24、36、48 和 72 小時，用 CCK8 試劑盒（n = 3）測定細胞活力。

所有數據均以均數±SEM表示，n= 3個獨立實驗中的一個代表重複。ns(無統計學意義)，*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001

圖四：Piezo1 通道介導的鐵過載導致線粒體功能障礙、氧化應激和脂質過氧化。

a. NPCs暴露於高鐵環境，用Yoda1或GsMTx4處理24小時的代表性TEM圖像。箭頭表示線粒體萎縮。

b. DCFH-DA細胞內ROS檢測及相對MFI定量分析。

c. 用Mitotracker評估npc的線粒體功能。

d/e. 線粒體功能標記物、鐵代謝標記物和鐵死亡標記物的WB分析。(n = 3).

f. Mitotracker相對MFI的定量分析。

g. 對不同化學刺激處理24 h的NPCs的鐵代謝基因和鐵死亡基因進行PCR分析並定量（n = 3）。

h. 採用JC-1法測定NPCs線粒體膜電位。

i/j. 通過ImageJ軟件分析相對MFI (n = 3)。

k. 氧化BODIPY-C11熒光代表性直方圖。

l. C11 BODIPY 581/591評價NPCs細胞內脂質ROS。

m. 鐵含量測定試劑盒顯示不同類型細胞經過不同化學刺激處理24 h後的細胞內Fe2+含量(n = 3)。

所有數據均以平均值±SEM表示，n = 3次重複，從3個獨立實驗的一個代表中進行。ns(無統計學意義)，*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001

圖五：Piezo1誘導的鐵內流與TFRC無關。

Tfrc-siRNA轉染後，在1MPa機械刺激24h 下，用或不用GsMTx4處理的大鼠NPC

a. 轉染後大鼠NPC的形態。

b. NPCs的PCR和WB分析和定量（n = 3）。

c. 細胞內相對Fe2+和MDA的定量分析。

d-f. 轉染後使用 FerroOrange、DCFH-DA和 Mitotracker 拍攝NPC的代表性圖像 （n = 3）。

g. 在用 si-NC 和 si-Tfrc 轉染（n = 3）後，經機械刺激處理24h的NPC中TFRC、FPN、DMT1、FSP1和GPX4的蛋白質印跡分析。在高鐵環境和 Tfrc-siRNA 轉染下，用或不用Yoda1或GsMTx4刺激處理的大鼠NPC。

h. NPCs 24 h時具有代表性的細胞形態變化。

i. 轉染後定量細胞內相對Fe2+和MDA (n = 3)。

j-l. 採用FerroOrange、DCFH-DA、Mitotracker等工具對npc進行代表性圖像採集。並通過ImageJ軟件分析相對MFI (n = 3)。

m/n. 轉染和定量後,機械刺激處理24h的npc (n = 3)的Western blot分析(n = 3)。

所有數據均表示爲平均值±SEM, n = 3個獨立實驗中一個代表性的重複。ns(無統計學意義)，*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001

圖六：Piezo1通道的缺陷會通過GPX4減弱IVDD的發展。

a. Piezo1-cKO、Gpx4-cKO、Piezo1/Gpx4-cKO小鼠動物實驗流程圖。

b. 針刺後小鼠尾椎盤的X射線、MRI和Micro-CT圖像。

c. x射線、MRI和Micro-CT定量分析(n = 3)。

d. WT、Piezo1- cko、Gpx4-cKO和Piezo1/Gpx4-cKO小鼠的Safranine O-Fast Green染色。標尺，250 μm。

e. 小鼠ACSL4、COL2、Aggrecan免疫組化檢測。標尺，250 μm。

f-h. 不同小鼠ACSL4、DMT1、FSP1免疫熒光染色分析。標尺，200 μm。

i. 免疫熒光染色、Safranine O-Fast Green染色及免疫組織化學定量分析(n = 3)。

所有數據均以均數±掃描電鏡(SEM)表示，n = 3個重複，每3個獨立實驗中有一個代表性。ns(無統計學意義)，*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001

總結

在這項研究中，作者發現 Piezo1 是椎間盤退行性變中鐵代謝的關鍵調節因子。但是，應注意幾個限制。儘管 Piezo1 的遺傳阻斷在成像和免疫熒光中減弱了 IVDD 過程，但對組織學切片上某些分子的統計分析表明，雙cKO小鼠比Gpx4-cKO小鼠具有更嚴重的表型，這表明有更多的參與者參與這一過程。對Piezo1和Gpx4在基因水平或蛋白質或脂質水平上調節 NP 細胞的確切機制仍然知之甚少。本研究表明，機械應力誘導Piezo1活化在鐵代謝和鐵死亡的調節中起着至關重要的作用。Piezo1通道的激活導致細胞內鐵過載，最終細胞以應激反應方式導致鐵死亡。而後Piezo1通道的激活是以非依賴TFRC性的方式直接介導鐵內流，這可能發生在早期階段，並伴有TFRC的反饋下調。最後，Piezo1或其抑制劑GsMTx4的缺失可以逆轉鐵過載，Piezo1-鐵鐵死亡軸可能是機械應力誘發疾病的一種新治療方法。