Nature綜述：選擇性剪接作為表型多樣性的來源。

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動植物分類羣特徵在於形態多樣性，這反映了DNA與環境差異的結合。自1970年代起，人們發現表型多樣物種可擁有相似編碼序列，這表明調控序列主導表型差異。人類全基因組關聯研究顯示，與可遺傳特徵相關的遺傳變異中有88%位於非編碼基因組區域。

基因調控變異在形態進化中扮演重要角色，它涉及可遺傳控制變異，導致蛋白質組多樣性。儘管轉錄調控受到廣泛關注，但共轉錄和轉錄後機制，如選擇性剪接（AS），也參與調節遺傳變異。這些機制使單個基因能夠編碼多個轉錄本和蛋白質，進而編碼不同的表型。AS尤其有效，能夠擴大基因編碼能力並調節蛋白質表達水平。然而，AS在產生表型多樣性中的作用相對較少受到關注。

1977年發現哺乳動物細胞中的剪接機制，引起對“外顯子洗牌”影響真核基因和蛋白質進化的興趣。剪接是基因表達的關鍵，但AS揭示其促進基因調控的新形式，使單個基因產生不同功能的蛋白質。轉錄組學研究顯示，AS在真核生物中普遍存在，約90-95%人類基因經歷AS。

變異轉錄本來自七種AS事件及外顯子上的替代轉錄起始和多聚腺苷酸化位點。這些事件可形成更復雜的AS事件，如盒式外顯子。多個AS事件可影響轉錄本，不協調可產生多樣性。AS事件的相對重要性和範圍在真核生物中差異大。例如，外顯子跳躍在後生動物中常見，內含子保留在植物和真菌中更常見。   

自AS現象發現後，人們對其進化機制產生疑問。一篇論文展示了多物種、多組織的進化轉錄組學景觀，發現共調節的組織特異性AS事件保守比例較小，最高保守事件發生在大腦、心臟、肌肉和睾丸。AS在功能上可能不如轉錄控制重要，但爲快速進化創新提供機會。AS影響重要表型，但功能大多未知。過去，AS對蛋白質組影響的推論受限於短讀長RNA測序。現在，長讀長RNA測序可揭示完整轉錄本的複雜性及預測蛋白質亞型，深入瞭解對錶型變化的影響。例如，長讀長RNA測序鑑定了Dscam1的數千個對神經迴路發育重要的完整轉錄本亞型。隨着轉錄組數據的增加，人們對AS在產生表型多樣性中的作用重新產生興趣。

在這篇綜述中作者系統地梳理了AS的發生機制及其所服務的多樣化功能角色，特別是在蛋白質組多樣性、發育過程以及表型可塑性等方面所發揮的作用。作者深入剖析了AS的進化歷程，並詳細探討了剪接變異在推動進化變化中的重要作用，這些變化涵蓋了適應性演化和物種形成等多個層面。最後，作者亦對AS因自然選擇而發生的分化現象進行了深入的探討和證據分析。

真核生物前mRNA剪接由剪接體協調，剪接體在內含子上逐步組裝，催化內含子去除，並通過RNA催化中心將外顯子剪接在一起。剪接體組裝由剪接因子精確協調，識別內含子末端的短共識序列。這一過程受到複雜網絡調節。剪接體通常在內含子上組裝，稱爲內含子定義。當外顯子兩側是長內含子時，早期複合物可能在外顯子側翼間組裝，稱爲外顯子定義。外顯子定義複合物需並列和重新排列，形成成熟剪接體。外顯子定義的關鍵證據是，單個剪接位點突變會導致外顯子跳躍，而不僅僅是保留內含子。   

從調控角度看，拼接複合組裝路徑決定拼接調控模式；內含子保留與定義相關，外顯子定義與跳躍或包含相關，在動物進化中更普遍。從進化角度看，外顯子定義的重要推論是，序列變異常導致完整外顯子的包含或跳過，導致替代蛋白質編碼亞型。相比之下，內含子保留在植物中最常見，導致RNA降解。儘管外顯子定義有解釋力，但新生RNA測序顯示，許多長內含子在下游外顯子轉錄時被剪接，排除外顯子定義的貢獻。

在許多場合中，AS在功能層面上具有不可忽視的重要性。它實現了蛋白質組的多樣化，成爲發育過程中至關重要的調控機制。同時，AS還有助於促進所有生命階段對環境變化的靈敏反應。

AS對蛋白質組的貢獻

AS事件轉化爲功能性蛋白質變異的程度存在爭議。雖然許多AS事件被認爲是剪接錯誤且非功能性的，但一些子集卻對功能性蛋白質多樣性和表達水平有調節作用。非功能性AS事件爲新功能演化提供了潛力。替代轉錄本可導致蛋白質在結構、功能等方面存在差異，如調節神經線路的果蠅轉錄因子的AS。AS增加了蛋白質網絡的複雜性和互連程度。不同生物體使用AS的方式可能不同，如植物主要利用AS響應脅迫進行定量基因調控，而動物則主要用於產生組織特異性蛋白質組。   

如何通過亞型切換微調蛋白質-蛋白質相互作用。例如，AS事件調節轉錄因子FOXP1的DNA結合偏好。在人類胚胎幹細胞中，FOXP1轉錄本含外顯子18b，上調多能性基因。相反，含外顯子18則促進細胞分化。跨物種比較顯示，FOXP1的外顯子18和18b在脊椎動物中高度保守，表明AS介導的多能性維持保守。

除了影響蛋白質亞型轉換，AS還定量影響蛋白質表達水平。AS通過改變非翻譯區域序列影響mRNA翻譯效率，並與mRNA降解機制偶聯影響轉錄本穩定性。內含子保留常導致細胞覈保留、過早終止密碼子（PTC）和細胞質無義介導的衰變（NMD）。儘管NMD主要處理異常轉錄本，但調節的AS使NMD也作用於含PTC的mRNA。含PTC內含子保留、毒物外顯子包含和移碼誘導外顯子跳躍均可能導致NMD。AS-NMD常用於剪接因子間的自動調節和交叉調節。例如，PTBP1在自動調節環中誘導PTBP1 mRNA中保留框架的外顯子部分跳過，以保持PTBP2表達關閉。人類剪接調節性SR蛋白家族含有毒外顯子，這些區域介導家族成員間的交叉調節。許多毒外顯子對細胞適應性至關重要，但部分缺失也導致小鼠腫瘤發生增強，強調AS在定量基因調控中的重要性。儘管並非所有預測的AS-NMD亞型都經歷NMD，但有許多功能性AS-NMD例子記錄在案，特別是剪接因子家族。

AS調控發育

AS在分子水平上影響生理系統。性別決定是受AS控制的基本發育過程之一。果蠅中，調節性別決定的AS事件級聯反應得到較好理解，涉及dsx基因的性別特異性剪接。這種剪接在多種昆蟲中保守，表明其在性別決定中的古老起源和作用。AS也在變溫爬行動物性別決定中發揮作用，響應溫度微小變化。在海龜中，溫度調節激酶CLK1/4磷酸化SR蛋白，影響SR蛋白覈定位，切換AS事件，導致不同性別發育。CLK1/4激活溫度精細調節，響應變溫相關溫度範圍及生理冷熱休克和晝夜節律。

AS介導表型可塑性

溫度依賴性性別決定是表型可塑性的一個例子，生物體會根據環境線索改變其表型。AS通過改變發育基因的替代轉錄物表達或調節總體表達水平來促進表型可塑性。例如，AS通過調節開花基因座M(FLM)的表達，在擬南芥的開花時間調控中起關鍵作用。機制涉及FLM-亞型的互斥轉換，該亞型在低溫下產生並與花抑制因子相互作用。最近的數據表明，AS開關通過產生多種非生產性mRNA亞型來降低FLM-β水平。在羣居昆蟲的種姓系統中，也可看到顯著的表型可塑性。比較分析表明，AS是白蟻、蜜蜂和潛在螞蟻種姓差異的一個促成因素。在黃尾大黃蜂中，許多基因表達多種亞型，其中許多是種姓特異性的。AS也被認爲在蝴蝶季節性可塑性的基因表達變化中具有互補作用。然而，對AS因果作用的功能研究仍需在所有這些系統中進行。

越來越多的證據表明AS在形成表型性狀中起關鍵作用，因此瞭解其分子進化和對選擇壓力的反應變得十分重要。影響剪接位點選擇和剪接體組裝的突變會引發新的剪接模式，這些突變分爲順式和反式效應。順式效應主要包括外顯子複製、轉變、外顯子化和內含子化。反式效應則直接影響反式因子的編碼序列或表達水平，導致AS轉錄物表達水平的變化。

外顯子複製

外顯子重複及防止包含兩個外顯子的機制是互斥外顯子(MXEs)的來源。MXEs中，一個外顯子拷貝保留祖先功能，另一個則可能變化產生新功能。例如，在α-actinins和酮戊二酸脫氫酶中，MXEs影響鈣離子結合和反應性。古老且高度保守的MXEs在昆蟲Dscam基因中廣泛存在，且個體陣列內的變體關係比等效陣列更密切。

過渡

轉變事件可致蛋白質序列和功能的模塊化丟失。外顯子剪接變化可由突變影響剪接共有序列或調節元件導致。FAS的外顯子6展示了靈長類動物進化中的有趣轉變。祖先FAS是促凋亡膜受體，而靈長類特異性亞型缺乏外顯子6，爲可溶性循環亞型，作爲拮抗劑與祖先亞型競爭。分析人類與祖先靈長類外顯子序列變體，發現單個突變對外顯子包含有複雜非線性影響，與剪接位點競爭相關。機器學習顯示，僅少數外顯子在外顯子變異下經歷顯著包涵體變化，大多數則逐漸改變包含水平。綜上，轉變可能通過一系列影響剪接增強子或沉默子的序列變異逐步發生。與剪接位點序列突變的災難性影響相比，這種增量變化可能更適合維持祖先功能並探索新亞型功能。   

外顯子化

許多外顯子化事件是通過在逆轉錄轉座子中產生剪接位點或失去沉默序列產生的。例如，靈長類動物基因組中的Alu元件產生了大量譜系特異性外顯子。這些外顯子通常具有低包涵體水平，主要具有調節功能。系統分析確定了33個Alu衍生的外顯子，其中一些具有高水平或動態調節，但功能不明確。

雖然重複元件作爲新外顯子來源得到理解，但小鼠和人類中僅不到20%的外顯子化事件來自短散佈元件（SINE）。大多數新外顯子來自獨特序列。一類譜系特異性新外顯子作爲第二個外顯子出現，影響5'非翻譯區域。這些外顯子的包含與更高轉錄水平相關，突顯了啓動子-近端剪接提高轉錄水平甚至激活新啓動子的機制，增強亞型多樣性。

順式效應與反式效應的平衡

由順式效應和反式效應指導的AS變化進化後果不同。順式輸入改變通常導致局部剪接變化，而反式成分擾動可能導致廣泛剪接變化。儘管有區別，但順式與反式調節突變對AS進化的相對重要性尚不清楚。

反式作用調節位點突變可協調改變轉錄本和蛋白質，支持此觀點的證據包括交易調節因子的功能差異。例如，PTBP1外顯子9在哺乳動物中有時被跳過，而在雞中總是包含。外顯子跳躍降低了PTBP1抑制活性，導致早期神經元分化中的AS變化。雞細胞中同源外顯子缺失導致哺乳動物樣AS變化。這表明順式驅動的AS變化如何導致反式剪接變化。然而，影響反式調節因子編碼序列的突變可能有害，如人剪接因子突變與骨髓增生異常相關。同樣，剪接阻遏蛋白耗竭導致廣泛的外顯子化。但AS的進化創新也可驅動跨性別變化，如早期雙側動物中獲得的SRRM2/3/4剪接因子的eMIC結構域，促進了神經元特異性微外顯子的AS程序進化，對大腦發育和功能至關重要。   

總體而言，雖然剪接調節因子在物種間存在差異，但順式作用效應更常見。在秀麗隱杆線蟲中，大部分菌株特異性AS數量性狀位點受局部調控，顯示順式調節基礎。多數脊椎動物特異性剪接模式也受順式控制。然而，AS模式變異的基礎仍需深入研究，因爲有些研究發現跨調節變異的影響更大。

進化不一定依賴從頭突變，新亞型可來自滲入或已存在的遺傳變異。新型拼接形式也如此。例如，向日葵馴化涉及馴化相關剪接模式的滲入及野生近親中剪接模式頻率變化。AS變化方式多樣，表明AS易突變，進化變化空間大。

真核生物在表型多樣性和複雜性方面表現出巨大的差異。AS的功能角色，以及AS可以演變的多種方式，使得它可能在複雜性和多樣性的演變中發揮了作用。

複雜性的演變

複雜性的遺傳基礎定義爲不同細胞類型的數量一直存在爭議。研究發現，蛋白質編碼基因的總數無法解釋真核生物中細胞多樣性的增加。例如，人類和蛔蟲秀麗隱杆線蟲的基因組都有約20,000個蛋白質編碼基因。爲了解釋生物體複雜性與總基因含量之間的不良相關性（“G值悖論”），已經提出了許多基因組特徵，如AS、microRNA、長鏈非編碼RNA和非編碼DNA。在這些特徵中，AS尤爲引人注目，因爲它允許多個轉錄本，從而使蛋白質源於單個基因。   

比較轉錄組學研究顯示真核生物間AS程度存在很大差異。直接比較47種不同真核生物物種的AS水平顯示，AS的患病率與生物體複雜性密切相關，脊椎動物AS水平最高。考慮轉錄本覆蓋率的差異後，AS是生物體複雜性的強預測因子，但此發現僅基於12個物種，需進一步研究。另一項研究發現，在雙側動物進化過程中，外顯子跳躍頻率增加，與剪接體組裝中外顯子定義的基因結構有關。然而，需進一步理解AS隨複雜性擴展的重要性，尤其考慮到很多AS事件可能是非功能性的。

AS快速進化變化中

瞭解形態變化的遺傳基礎是進化發育生物學的核心挑戰。AS事件的變化可導致表型變化，並在進化中促進快速變化。重要問題是：剪接基因座是否加速進化，以及AS譜變化對種間表型差異的解釋程度。我們使用“發散剪接”來描述譜系間剪接譜的發散。

已確定同一物種和密切相關物種間的差異剪接，如小鼠亞種和馴化向日葵與野生祖先之間的差異。頭蝨和體蝨間的差異剪接與生態位和傳播疾病能力不同有關。儘管基因組測序和表達數據顯示兩者間差異極小，但深度轉錄組學揭示了超過3,500種特有事件。AS差異與唾液腺過程相關，可能影響載體能力，但功能研究仍待進行。因此，AS模式與物種形成相關聯，但分化在功能上與物種形成過程的關聯程度尚待觀察。   

剪接有助於物種發散的一種方式是引起減少基因流的表型變化。例如，Capsella rubella從近交祖先Capsella grandiflora進化成自交物種，決定性變化是花瓣大小減小。QTL分析確定CYP724A1爲致病基因。自交形態中的兩個SNP導致更有效地去除內含子，提高CYP724A1水平，進而限制花瓣細胞增殖，導致花瓣減小。這些SNP被證明足以減小花瓣。因此，剪接效率的變化導致花瓣變小，介導了從近交到自交的轉變。

在某些情況下，大效應基因的差異剪接與適應性狀和生活史策略進化相關。例如，寄生開普蜜蜂工蜂的遺傳基礎與gemini142，143基因的AS變化有關。通常，只有交配的皇后能產生女兒，但工蜂有時會逃避這種控制，產生後代威脅蜂王地位。寄生工人gemini中9-bp缺失與外顯子7中5'剪接位點使用增加相關。這導致CP2結構域中8個氨基酸缺失，可能改變gemini活性，導致卵巢激活基因更高表達。皇后和寄生工人具有相似的外顯子7剪接位點選擇比率。此外，gemini外顯子5的包含水平也影響A.mellifera carnica亞種卵巢激活。

通常，剪接變化通過產生非功能性蛋白質來調節性狀，而非改變或獲得新功能。例如，捕食者驅動的發散選擇導致三棘棘魚因MSX2A剪接變化而進化出更短刺。在淡水刺魚中，高比例MSX2A轉錄物編碼非功能性截短蛋白，與海洋刺魚的全長MSX2A蛋白不同。淡水等位基因的變化激活選擇性剪接位點，證實剪接差異在調節MSX2A中的作用。洞穴魚適應食物匱乏與per2的剪接變化相關，導致Per2蛋白活性降低。洞穴種羣通過上調脂肪生成基因表達來耐受低食物可用性，通過增加PPAR γ表達實現。Per2的剪接變化導致C-末端結構域丟失，適應營養限制環境。類似剪接變化也在其他洞穴魚種羣中發現，提高了Per2在洞穴適應中趨同進化的可能性。   

有趣的是，最近的研究表明AS可能有助於性別特異性適應進化，特別是在基因表達模式變化受限的情況下。AS能使轉錄物僅在受益的性別中表達。比較多種鳥類的性別間AS模式，發現數百個與表型性別差異相關的性別特異性剪接模式基因。例如，野生火雞中，優勢雄性有獨特的羽毛特徵，而從屬雄性介於兩者之間的表型及剪接譜。此外，性別特異性剪接模式由性選擇驅動，具有性別特異性效應。這表明性別特異性AS事件可促進性別特異性適應。

總體而言，發散剪接與進化的適應性變化有關，但剪接變化影響給定性狀的確切機制尚不完全清楚。未來，需要深入剖析潛在的機制，以闡明表型變化的常見途徑，如蛋白質功能喪失或功能結構域轉換。

AS和轉錄控制程序影響組織內不同互補基因組。相關人羣研究表明，AS和mRNA丰度差異已影響不同基因集，即使在較短的進化時間尺度上。例如，北極charr生態型間差異剪接和表達的基因參與不同過程，重疊率不到6%。AS在進化上可能比基因表達更靈活，因爲它可以改變受限基因同工型的平衡，同時維持必需同工型的表達。   

研究表明，剪接比基因表達分化更快，爲快速適應提供了替代途徑。脊椎動物器官轉錄組比較顯示，AS模式迅速分化，物種間剪接變異超過組織內變異。組織水平基因表達譜保守。然而，這些模式基於長期進化，短期進化研究更具可變性。例如，近期分化慈鯛物種間砷和基因表達差異三倍於基因表達差異，北極charr生態型間也有相似差異。剪接和基因表達差異率不能單獨確定對進化的貢獻，因剪接與轉錄水平相關，影響轉錄穩定性。總之，有證據表明剪接和其他監管變化在分化和生態物種形成早期階段發揮重要作用，但需更多研究，特別是在短期進化時間尺度上。

AS譜差異可能反映AS調節的寬鬆選擇，進而體現非功能性轉錄組噪聲或譜系特異性創新。確定AS事件的適應性、中性或輕度有害性是領域關鍵挑戰。一種方法是繪製控制AS的遺傳變異，揭示其進化史。在向日葵中，鑑定了影響剪接體蛋白的反式剪接QTL，這些QTL在馴化和野生種羣間及與馴化性狀相關的基因間存在差異。AS與人工選擇性狀的關聯表明選擇驅動了AS的快速分化。

物種間比較顯示，AS的快速分化主要由遺傳漂移驅動。例如，靈長類動物中替代外顯子的保守性有限，其差異影響較小。這種保守性表明進化速率較快，與弱選擇壓力和缺乏功能相關。人類全基因組遺傳變異數據表明，替代外顯子的非同義至同義取代比率較高。這可能是因爲替代外顯子表達水平較低，經歷的選擇較弱。AS率較高的基因通常表達水平較低，內含子較少。這表明AS的變化主要由弱選擇壓力引起的剪接錯誤驅動。因此，儘管一些替代轉錄物在某些環境下仍具功能，但AS譜中的大多數差異似乎由漂移驅動。   

有人提出，AS在中性條件下大量進化，能爲現有基因提供新功能，獲得適應性益處。選擇性外顯子首次出現時，由於弱剪接位點，可能只包含在一小部分轉錄物中，不太可能破壞正常蛋白質功能。隨時間推移，替代外顯子可獲得額外突變，在寬鬆選擇壓力下快速進化。低包涵體水平的外顯子經歷更多進化變化，導致替代轉錄物長期變異，大多無功能。但特定替代轉錄物若獲得有用功能，如環境變化時，選擇可通過加強剪接位點增加其表達。普通吸血蝙蝠中的熱敏離子通道TRPV1是此過程的例子。TRPV1基因在兩物種中均含外顯子14a，但僅在吸血蝙蝠面部特化凹坑器官的三叉神經纖維中表達。外顯子14a的包含導致TRPV1結構域截短，使其在較低溫度下激活，實現紅外檢測，是關鍵的適應。新外顯子受動態調節，TRPV1的祖先剪接模式及熱傳感器功能得以保留。先前編碼但休眠的替代外顯子快速進化可促進譜系特異性適應。

最近，有人提出NMD可以作爲對抗AS變異影響的緩衝劑。NMD通過降低異常轉錄物的表達，允許生物體探索AS的景觀，同時避免潛在的有害影響。這種隱藏的遺傳變異積累可能增強未來的適應性。然而，這一理論類似於進化電容理論，仍需實驗證據支持，緩衝的具體機制也需進一步探究。

偶爾，剪接變化會產生適應性和有害影響，導致權衡。一篇論文指出，類人猿進化中尾部丟失與TBXT基因轉錄本中的外顯子跳過事件有關。Alu元件插入TBXT基因導致轉錄物中外顯子跳躍。小鼠模型顯示外顯子跳躍導致尾部減少或缺失。尾巴缺失的選擇性優勢與兩足動物進化及非樹棲生活方式過渡相符。因此，剪接變化相關的進化權衡可能仍影響人類健康。

自1977年發現內含子以來，人們認爲AS具有加速進化變化的潛力。生物化學家沃爾特·吉爾伯特提出替代轉錄本理論，即蛋白質可通過剪接位點附近突變進化，產生多個轉錄本，實現進化中的新舊解決方案並存。

最近研究顯示，AS是適應性進化變化的重要貢獻者，與其他遺傳變異相互作用。多數剪接變異可能中性或輕度有害，爲生物噪音而非功能變異。但這種噪音可能成爲有用遺傳變異，未來通過選擇產生功能變異。理解漂移和選擇的相互作用對確定AS在表型變異和複雜性中的作用至關重要。

挑戰在於結合全基因組方法與分子研究，剖析AS在蛋白質組學和表型水平上的功能後果。隨着長讀長RNA測序和CRISPRCas9基因組編輯的普及，現在有多種工具可用。同時，高質量染色體組裝增多，有助於探索整個生命之樹的AS，深入瞭解AS變異在進化功能上的程度。

由於替代轉錄本具有組織或細胞類型特異性，單細胞轉錄組學將爲AS提供重要見解，特別是在複雜AS組織中，如大腦。然而，單細胞中AS的定量分析存在技術和計算挑戰，儘管正在開發考慮技術限制的計算方法。

總之，AS是塑造多細胞真核生物進化景觀的有效機制，具有調節和進化的雙重靈活性。期望未來研究將更深入地闡明AS對生物學過程的影響，加深對轉錄調節的理解。

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